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western原理ppt

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Western blot 原理 分類 主要試劑 操作步驟 常見問題 原理 Western Blot(蛋白免疫印跡)采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 。 分類 SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳) native-PAGE(非變性聚丙烯酰胺凝膠) 區別在于加不加變性劑(比如SDS)使蛋白質變性,SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質的電泳方式特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量 主要試劑 1.ddH2O 2.30% 丙烯酰胺混合液   丙烯酰胺(arc)29g和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺(bis)1g加H2O至100ml。儲于棕色瓶,4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0,因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月,隔幾個月須重新配制。如有沉淀,可以過濾。 為蛋白質電泳提供載體,其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否。 主要試劑 3.  配膠緩沖液系統 分離膠緩沖液:1.5mol/L Tris-HCL(pH 8.8) ; 濃縮膠緩沖液:1.0mol/L Tris-HCL (pH 6.8); 電泳緩沖液: 5XTris-甘氨酸緩沖系統, 4℃保存 5×電泳緩沖液(貯存液)的配制: 0.125 M Tris 15.1 g 1.25 M Glycine 94 g 0.5 % SDS 5 g 三蒸水定容至 1000 mL 主要試劑 在SDS-PAGE不連續電泳中,濃縮膠其pH環境呈弱酸性,因此甘氨酸解離很少,其在電場的作用下,泳動效率低;而Cl離子卻很高,兩者之間形成導電性較低的區帶,蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比,這一區帶便形成了較高的電壓梯度,壓著蛋白質分子聚集到一起,濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠后,由于膠中pH的增加,呈堿性,甘氨酸大量解離,泳動速率增加,直接緊隨氯離子之后,同時由于分離膠孔徑的縮小,在電場的作用下,蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。 主要試劑 4. 10%  十二烷基硫酸鈉SDS溶液 是陰離子去污劑,作為變性劑和助溶試劑 去蛋白質電荷; 斷裂分子內和分子間的氫鍵,取消蛋白分子內的疏水作用;使分子去折疊,破壞蛋白分子的二、三級結構,常溫保存。 主要試劑 5. 10% 過硫酸銨(AP) 催化劑,催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺,4℃保存,一周內使用 0.1g過硫酸銨溶于1mlddH2O中 主要試劑 6.四甲基乙二胺TEMED 催凝劑,加速AP催化作用,在聚合過程中,TEMED催化過硫酸銨產生自由基,后者引發丙烯酰胺單體聚合,同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯,從而形成三維網狀結構 主要試劑 7. 8×SDS-PAGE Loading Buffer溶液(上樣緩沖液) loading buffer的功能主要有兩個: 第一,里邊的指示劑溴酚藍起到指示的作用,它是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,以便我們適時終止電泳; 第二,里邊的成分甘油可以加大樣品密度,使其沉降到點樣孔中,防止樣品飄出點樣孔。 SDS主要是促使聚合酶變性,因為沒有除盡的聚合酶會結合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。細胞裂解后的裂解液,加loading 100℃加熱,也是為了中止酶促反應,防止提取的蛋白質降解。 主要試劑 8.10×轉印Buffer(貯存液) 4℃保存 10×轉印Buffer(貯存液)的配制: 0.25 M Tris 30.28 g 1.92 M Glycine 144.13 g 三蒸水定容至 1000 mL 1×Transfer Buffer(工作液): 10×Transfer Buffer 100 mL 三蒸水 700 mL 20 % 甲醇 200 mL 主要試劑 9.甲醇 轉膜液中主要是降低電導的作用,防止轉膜溶液過熱。 10.聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜 PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規的膜要高,非常適合于低分子量蛋白的檢測,用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上 的正電基團,使其更容易與帶負電荷蛋白結合。 主要試劑 11.三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液Tris buffer saline(1×TBS) 洗去Tween,因為Tween會影響發光 10 mM Tris-HCl (pH=8.0)1 M 10 mL 150 mM NaCl 5 M 30 mL 三蒸水定容至 1000 mL 12. Tris buffer saline Tween( TBST)緩沖液 洗去未結合的抗體 1×TBS 1000 mL 0.05 % Tween-20 0.5 mL 主要試劑 13.封閉緩沖液 封閉膜上的非特異性蛋白結合位點,防止一抗、二抗的非特異性反應 TBST Buffer 100 mL 5 % Nonfat Milk 5 g 14.一抗 15.二抗:羊抗兔IgG/HRP(辣根過氧化酶) 使試劑中的發光物氧化并發光 16. ECL檢測試劑 操作步驟 操作步驟 1.細胞總蛋白提取及定量 2.配膠 3.制膠 先用1ml槍頭小心鋪12%分離膠,上加少許ddH2O,待分離膠干凝后,倒去ddH2O ,用濾紙吸干。再鋪8%濃縮膠,注意不要產生氣泡,斜插上梳子,待膠干后備用,拔去梳子。 4.上樣 所有上樣孔均加樣,沒有樣本,用上樣緩沖液代替。 5.電泳 取40 μg蛋白經8%濃縮膠電泳80V 30min,12%分離膠電泳110V 90min。 6.轉膜 電泳結束后,切除濃縮膠,按照負極-3張濾紙-分離膠-PVDF濾膜--3張濾紙-正極的順序,組裝電轉膜體系,100V 轉膜25min。 操作步驟 7.PVDF膜的免疫學檢測 PVDF膜經5%脫脂奶室溫封閉1 h→一抗4℃溫和震蕩過夜→TBST洗滌三次→HRP標記二抗室溫溫育1 h→TBST洗滌三次后,應用化學發光底物檢測試劑盒進行檢測 8.結果分析 以GAPDH為內參照,以靶蛋白/內參照灰度的比值作為蛋白的相對表達含量,進行半定量檢測 常見問題 1.分離膠濃度 根據目的蛋白分子量選擇膠的濃度 蛋白分子量 (kDa) 凝膠濃度 (%) 4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-200 8 常見問題 2. 在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續性,這是為了控制慢離子的解離度,從而控制其有效遷移率.要求在樣品膠和濃縮膠中,慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低,以使樣品夾在快、慢離子界面之間,使樣品濃縮.而在分離膠中慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高,使樣品不再受離子界面的影響. 常見問題 3. 加入分離膠后,立即覆一層雙蒸水,一是為了使分離膠界面保持水平,用水就可以把它壓平,使蛋白質分子跑時在同一水平線上;二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。也可以覆蓋一層無水乙醇。 常見問題 4. 從轉膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜保濕,避免膜的干燥,否則極易產生較高的背景。 5.膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會發生短路 6.電轉移時會產熱,在槽的一邊放一塊冰來降溫 7.切濾紙和膜時,一定要戴手套,因為手上的蛋白會污染膜 常見問題 8.二抗的選擇根據一抗的種屬來源,如:一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗體,則二抗應選擇山羊或其他來源抗兔的抗體,而且二抗要標記有同位素或酶。 9.條帶兩邊擴散:加樣量過多 10.條帶兩邊高,中間凹   原因:凝膠不均勻冷卻,中間冷卻不好; 電泳系統溫度偏高 常見問題 11.條帶呈皺眉狀,中間高,兩邊低   原因:可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,或者兩邊聚合不完全 12.條帶有拖尾現象 原因:樣品溶解不好 13.混合攪拌速度時不宜太快,容易產生氣泡影響聚合,導致電泳帶畸形。 太慢不均勻,特別是甘油

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